Ｙ型ポリエチレングリコール修飾したｇ−ｃｓｆならびにその製造方法および使用

专利摘要:
本発明はＹ型分岐のポリエチレングリコールで特定のリジン部位（Ｋ１７）にシングルポイント修飾したＧ−ＣＳＦとその製造方法、ならびにこのポリエチレングリコール化Ｇ−ＣＳＦの製薬分野における応用を提供する。なし
公开号:JP2011507913A
申请号:JP2010539988
申请日:2007-12-29
公开日:2011-03-10
发明作者:フイリ カイ，；リー サン，；ピン チェン，；ジャンフア ツェン，；リーピン ツォン，；ホングヤン デン，；シューイン フアン，；ヤン ヘ，；メイフア ヤン，；シーヤン ワン，
申请人:バイオスティード ジーン エクスプレッション テック． カンパニー リミテッド；
IPC主号:C07K14-535

专利说明:

[0001] 本発明はＹ型ポリエチレングリコール修飾したＧ−ＣＳＦ（ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ）およびその製造方法、ならびにＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦを含む医薬組成物および使用に関する。]
背景技術

[0002] 顆粒球コロニー刺激因子（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆＦａｃｔｏｒ、Ｇ−ＣＳＦ）は骨髄細胞コロニーの形成を刺激するコロニー刺激因子の一つであり、特異的に顆粒球系の増殖、分化、生存と活性化を刺激し調節し、各原因による顆粒球減少症に潜在的で巨大な応用価値を持っている。]
[0003] ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子は１７番染色体のｑ２１〜２２にあり、全長が２．５ｋｂで、５つのエクソンおよび４つのイントロンからなって、成熟タンパクに１７４のアミノ酸を含んでいる。大腸菌で発現されたＧ−ＣＳＦ分子のＮ末端にまた一つのＭｅｔがあり、全部で１７５のアミノ酸であり、図１（配列番号１）に示す。当分子は合わせて５つのＣｙｓを含み、その中のＣｙｓ３７−Ｃｙｓ４３およびＣｙｓ３７−Ｃｙｓ４３が２対のジスルフィド結合になり、分子内には４つのＬｙｓ残基を含み、１７番目、２４番目、３５番目および４１番目にある。] 図１
[0004] 化学療法による好中球減少症、特に発熱性好中球減少症（ｆｅｂｒｉｌｅ ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ、ＦＮ）は化学療法を受けるがん患者に、とりわけ一番目の化学治療周期において最も普通で、通常に最も重い副作用である。ＦＮの結果、しばしば患者が入院検査または抗生物質治療を受けなければならない。余分の支出を負担するだけでなく、相当に高い死亡率を有する。もう一つの厳しい結果は好中球の減少によって、多くのがん患者の治療計画が変わらなければならない。例えば化学療法の薬物の服用量を降下し、次の化学療法周期を延期するなどであるが、これらのことは直接に最終の化学治療効果に関わっている。１９９１年ｒＨｕｇ−ＣＳＦ薬物の発売がＦＤＡに承認された以来、もう数百万人の化学療法を採用するがん患者はその利益を受けた。今その年間売上げは世界生物製剤のトップテンに入り、非常に将来性がある。]
[0005] だが、組み換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ｒｈＧ−ＣＳＦ）は体内循環半減期が短く（ｔ１／２が僅か１．３〜４．２ｈ）、効果持続時間が短く、酵素に加水分解されやすく、腎臓に排出されやすく、何度も注射が必要などの問題で、患者に対して不便だけでなく、繰り返して注射すると副作用が起こる恐れがあり、効果も限られる。]
[0006] 近年発展してきたポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）修飾技術は上述の問題の克服に可能な選択を提供する。]
[0007] ポリエチレングリコール（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧ）は無毒な水溶性の中性ポリマーであり、良好な生体適合性および血液適合性を有し、人体局部、胃腸および静脈投与に応用されることがアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）に承認された。タンパク質のＰＥＧ修飾技術とは、ＰＥＧ両端の一つあるいは二つの末端基が活性化され、所定の官能基を備え、この官能基は少なくとも結合させたいタンパク質に対して活性を持ち、共有結合によってＰＥＧをタンパク質の末端（Ｎ末端あるいはＣ末端）あるいは特定のアミノ酸に結び付けることを指している。ＰＥＧの作用部位は普遍性を持っている。]
[0008] ＰＥＧはエチレングリコールとエチレンオキシドのポリマーであり、カーボンワックスとも言われ、構造式を以下に示す。]
[0009] 普通のＰＥＧは分子量の増加にしたがって、その外観が無色の粘性液体（１９０〜６３０ダルトン）から、白い膏状体（９５０〜１０５０ダルトン）、白いワックス状あるいは片状の固体（＞１２００ダルトン）まで変わる。タンパク質およびほかの薬物の修飾に用いられるＰＥＧの分子量が通常巨大である（表１）。例えば、米国Ｒｏｃｈｅ社に発売されたＰｅｇａｓｙｓ（ポリエチレングリコールインターフェロンα２ａ注射剤、ペガシス）に採用されたＵ型分岐二本鎖ＰＥＧの分子量は４０ＫＤで、米国Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ社に発売されたＰｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ（ポリエチレングリコールインターフェロンα２ｂ注射剤、ペグイントロン）に採用された直鎖線性ＰＥＧの分子量は１２ＫＤで、米国Ａｍｇｅｎに発売されたＮｅｕｌａｓｔａ（商標登録；ポリエチレングリコール顆粒球コロニー刺激因子）に採用された直鎖線性ＰＥＧの分子量は２０ＫＤである。薬物中のＰＥＧ部分（あるいはＰＥＧ）の体内代謝プロセスはもう相当に明らかで、素晴らしく、安全的、副作用のない薬物改質剤として見られる。]
[0010] ]
[0011] タンパク質薬物は、ＰＥＧ化によりその性質が大幅に改善される。具体的には、薬物代謝半減期が延長し（表１）、免疫原性が低下し、安全性が向上し、薬効が増加し、投与頻度が少なくなり、薬物の溶解性と水溶性が改善され、タンパク酵素分解耐性が強くなり、薬の放出制御が容易になるなどである。米国特許第４１７９３３７号によると、ＰＥＧが酵素あるいはインシュリンと連結すると、タンパク質の免疫原性が低下し、同時にタンパク質原来の活性もある程度保留された。ＰＥＧ化による独特な効果は、タンパク質の体外活性が降下するが、体内活性が増加することである。米国特許第４１７９３３７号によると、ＰＥＧが酵素あるいはインシュリンと連結すると、タンパク質の免疫原性が低下する同時にタンパク質の活性も明らかに降下するが、タンパク質原来の活性がある程度残された。]
[0012] 薬物修飾に用いられるＰＥＧは線型構造および分岐鎖状構造が二種ある。例えば、米国Ｒｏｃｈｅ社に発売されたＰｅｇａｓｙｓ（登録商標；ポリエチレングリコールインターフェロンα２ａ注射剤、ペガシス）に採用されたのはＵ型分岐の二本鎖ＰＥＧ誘導体で、ＰＥＧの平均分子量は２６ＫＤ〜６６ＫＤの間であり、（米国特許５３８２６５７、１９９２年８月２６日出願、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．）、分子式を以下に示す。





ここで、ＲおよびＲ’は独立して関係のない低分子量アルキル基で、ｎおよびｎ’は６００から１５００までである。]
[0013] ２００２年にＦＤＡに承認され、Ａｍｇｅｎ社に発売されたＮｅｕｌａｓｔａ（登録商標；ポリエチレングリコール顆粒球コロニー刺激因子）に採用されたのは直鎖線性ＰＥＧ分子で、分子量は２０ｋＤである（米国特許５８２４７８４、１９９４年１０月１２日出願、Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．）。修飾反応式を以下に示す。]
[0014] Ａｍｇｅｎ社のＮｅｕｌａｓｔａ（登録商標）製品は、末端にアルデヒド基の着いたＰＥＧ修飾剤がタンパク質のＮ末端アミノ基を修飾し、シングルポイント修飾したＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦである。その特徴はＰＥＧとＧ−ＣＳＦがＣ−Ｎ結合で連結している。]
[0015] 配置の異なるＰＥＧでタンパク質を修飾し、産物の性状は明らかに区別している。文献で報告されたように（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ Ｃ，Ｓｃｈｉａｖｏｎ Ｏ，Ｃａｌｉｃｅｔｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ，１９９５，６（１）：６２〜６９）、支鎖ＰＥＧ修飾したタンパク質はｐＨ耐性、熱安定性および抗タンパク酵素分解能力においてすべて直鎖ＰＥＧより明らかに優れている。]
[0016] 一種の新規Ｙ型分岐二本鎖ＰＥＧ誘導体が中国特許ＺＬ０３８０１１０５．０に報告された。その基本の分子構造式を以下に示す。





ここで、ＰａおよびＰｂは同一または異なる親水性ポリマーである。ポリエチレングリコール、ポリプロピレン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンモルホリンあるいはそれらの共重合体で、特別に好ましくはポリエチレングリコールおよびその共重合体であり、
ｊは１〜１２の整数であり、
Ｒｉは水素、置換あるいは無置換のＣ１〜１２アルキル基、置換アラルキル基、アリール基またはヘテロアルキル基であり、
Ｘ１およびＸ２は独立して連結基であり、Ｘ１は（ＣＨ２）ｎであり、Ｘ２は（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２）ｎＯＣＯ、（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ、（ＣＨ２）ｎＣＯからなる群から選ばれる基であり、ｎは１〜１０の整数であり、
Ｆはヒドロキシル基、カルボキシル基、エステル基、アシルクロライド、ヒドラジド、マレイミド、ピリジンジスルフィドからなる群から選ばれる末端基であり、治療薬あるいはタンパクにあるアミノ基、ヒドロキシル基またはメルカプト基と反応して共有結合を形成してもよい。]
[0017] ＰａおよびＰｂは好ましくはポリエチレングリコールおよびその共重合体であるとき、その基本の分子構造式を以下に示す。]
[0018] このＹ型ＰＥＧの特許、タンパクに対する修飾はタンパクの遊離アミノ基において行い、非固定ポイントのタンパク修飾に属する。]
発明が解決しようとする課題

[0019] 既知の技術に、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド活性化法によってＹ型分岐のＮＨＳ−ＰＥＧを合成し、修飾に用いられる。ＮＨＳ−ＰＥＧの特徴は、ｒｈＧ−ＣＳＦのリジンの遊離アミノ基あるいは末端遊離アミノ基とアミド結合になり、アミド結合が体内で緩やかに加水分解され、ｒｈＧ−ＣＳＦの活性を回復させることである。しかし、今採用されたＹ型分岐のＮＨＳ−ＰＥＧは普遍的に高い活性を持ち、選択性の悪い問題があり、修飾部位に指向できなく、シングルポイント修飾の修飾物を得難い。]
課題を解決するための手段

[0020] 本発明は新規のシングルポイント修飾したＹ型ポリエチレングリコール化顆粒球コロニー刺激因子（ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ）に基づく。具体的に、本発明はＹＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦおよびその製造方法、ならびにＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦを含む医薬組成物および使用に関する。ここで、本発明のＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦは１７番目のリジン（Ｋ１７）にシングルポイント修飾したものである。前記Ｋ１７シングルポイント修飾したＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦを利用して、優れた動物体内治療効果を得た。このほかに、前記Ｋ１７シングルポイント修飾したＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦは血清薬物代謝半減期などにおいて明らかに改善されている。]
[0021] 一方、本発明に関連するＹ型ＰＥＧ誘導体（ＹＰＥＧとも書かれる）修飾したＧ−ＣＳＦ（ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦあるいはＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦとも書かれる）、その分子構造を以下に示す。





ここで、
ＰａおよびＰｂは同一または異なるポリエチレングリコールであり、
ｊは１〜１２の整数であり、
Ｒｉは水素、置換あるいは無置換のＣ１〜１２アルキル基、置換アラルキル基、アリール基またはヘテロアルキル基であり、
Ｘ１およびＸ２は独立して連結基であり、Ｘ１は（ＣＨ２）ｎであり、Ｘ２は（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨ２）ｎＯＣＯ、（ＣＨ２）ｎＮＨＣＯ、（ＣＨ２）ｎＣＯからなる群から選ばれる基であり、ｎは１〜１０の整数であり、
Ｆはヒドロキシル基、カルボキシル基、エステル基、アシルクロライド、ヒドラジド、マレイミド、ピリジンジスルフィドからなる群から選ばれる末端基であり、Ｇ−ＣＳＦにあるアミノ基、ヒドロキシル基またはメルカプト基と反応して共有結合を形成してもよい。]
[0022] 一つの態様において、本発明のＹ型ポリエチレングリコール化Ｇ−ＣＳＦは以下の構造式を持つ。





ここで、ＲおよびＲ’は、独立して低分子量のアルキル基、好ましくはメチル基であり、ｊは１〜１２の整数であり、ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数であり、好ましくはｍ＝ｍ’、かつ、ｍ＋ｍ’は好ましくは６００から１５００までである。この構造式中、Ｙ型分岐ＰＥＧはアミド結合によってシングルポイントでＧ−ＣＳＦ分子に連結する。]
[0023] 好ましい態様において、前記Ｙ型ポリエチレングリコール化Ｇ−ＣＳＦの中に、Ｇ−ＣＳＦは配列番号１の１７番目に対応するリジンの側鎖εアミノ基によってＹ型ＰＥＧの末端基カルボキシル基とアミド結合で連結する。]
[0024] 任意に、本発明のＧ−ＣＳＦは天然物から抽出、あるいは組み換えバイオテクノロジーによって得られたＧ−ＣＳＦである。好ましくは、前記Ｇ−ＣＳＦは天然物から抽出、あるいは組み換えバイオテクノロジーによって得られた、配列番号１の配列を有するヒトＧ−ＣＳＦ（ｈＧ−ＣＳＦ）である。さらに好ましくは、前記ヒトＧ−ＣＳＦは組み換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）である。ｒｈＧ−ＣＳＦは人工的に合成されたものであってよく、原核生物発現系、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたものであってもよく、真核酵母発現系、例えばピチア（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現されたものであってもよく、ほかの昆虫細胞系あるいは哺乳類細胞系、例えばＣＨＯで発現されたものであってもよい。天然あるいは組み換えＧ−ＣＳＦを製造する方法およびＧ−ＣＳＦとそのＹＰＥＧ修飾物の活性検査方法は当該技術分野において既存の技術である。]
[0025] もう一方、本発明がＹＰＥＧでＧ−ＣＳＦを修飾する方法に関する。一つの態様において、式ＩＩＩに示すＹＰＥＧを利用して、活性化した誘導体例えば、ポリエチレングリコールスクシンイミジルエステル（ＹＰＥＧ‐ＮＨＳ）を通じて、求核置換反応によって、ＰＥＧ部分を共有結合でＧ−ＣＳＦの１７番目のリジン残基のε‐アミノ基と連結する。





ここで、ＹＰＥＧ−ＮＨＳはＥＰ１４９６０７６によって造られる。]
[0026] Ｇ−ＣＳＦとＹＰＥＧとを反応させ、ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦを生成する反応式を以下に示す。]
[0027] 反応条件は穏やかであり、ｐＨ範囲は６．０〜１０にあり、好ましくは８．０で、温度は０〜２５℃であり、撹拌あるいはほかの混合手段が必要である。得たＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦに対して分子量分析を行い、分子量フィンガープリントグラフおよび膵酵素ペプチドマッピングならびにタンパク質のＮ末端序列測定などの技術によってＰＥＧ化の修飾部位を確認する。本発明者によると、本発明のＧ−ＣＳＦに対するＰＥＧ修飾はＧ−ＣＳＦの１７番目のリジンにおいて行い、この修飾産物をＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（１７）と記録する。]
[0028] 前記ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（１７）に対する分離と精製はイオン交換などの方法で行われる。本発明の好ましい態様における、造ったＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦを陽イオン交換カラムを通して、四つ目の活性ピークを収め、さらにＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００ＨＲカラムで精製し、純粋なＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（１７）を得る。]
[0029] 他の態様において、本発明は、治療にＧ−ＣＳＦを必要とする疾患を治療するために、本発明のＹ型ポリエチレングリコール化Ｇ−ＣＳＦ、あるいは本発明のＹ型ポリエチレングリコール化Ｇ−ＣＳＦを含む組成物の使用を提供する。前記本発明のポリエチレングリコール化Ｇ−ＣＳＦ、あるいはポリエチレングリコール化Ｇ−ＣＳＦを含む組成物は、Ｇ−ＣＳＦの臨床応用と同じように、いずれも顆粒球減少に関わる疾患、例えば重度感染、白血病などの治療に適用する。幹細胞移植および悪性固形腫瘍の化学放射線療法による顆粒球減少症（童英ら、“Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦの臨床応用の現状”，基礎医学と臨床 ２０００ Ｖｏｌ．２０ Ｎｏ．２ ｐ．１０１〜１０４）。動物体内実験の結果によると、Ｇ−ＣＳＦに比べて、本発明のＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦを使って、期待以上の動物体内実験効果をあげた。すなわち、総投与量を減少したうえに、同じあるいは向上した効果を得、具体的に実施例の部分を参照されたい。このほかに、本発明のＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦは血清薬物代謝半減期などの方面において明らかに改善されている。本発明のＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦは組成物の形式で患者に投与できる。前記組成物は、薬学的に有効投与量のＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦおよび薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む。好ましくは、前記組成物はマンニトール、アミノ酸、酢酸および酢酸ナトリウムを含み、アミノ酸は好ましくはアスパラギン酸、アスパラギンおよびグリシンである。前記組成物は適当な製剤に作られ、経験に富む医師によっていずれの許容的な方式で投与される。本発明は顆粒球減少症を治療する方法を提供し、本発明のＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦを含有する組成物を投与することも含む。]
図面の簡単な説明

[0030] Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。そのＭＷが１８８０１．７９、ＰＩが５．６２である。下線のアミノ酸は前記アミノ酸配列に対する理論的なＹＰＥＧ修飾部位であり、すなわちＮ末端アミノ基およびＬｙｓの上の遊離アミノ基を含んで全部で５つの理論的な修飾部位である。
陽イオン交換カラムでＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦを分離した活性ピークを示す図である。図に示す４つ目（４＃）のピークは目的ピークのＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（１７）である。
Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００ＨＲカラムでＹＰＥＧ−ＧＣＳＦを精製したピークを示す図である。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦでＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの分子量を測った結果を示す図である。
Ｍａｌｄｉ−ＴｏｆでＧ−ＣＳＦのペプチド断片に対するペプチドマスフィンガープリントの結果を示す図である。
Ｍａｌｄｉ−ＴｏｆでＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦのペプチド断片に対するペプチドマスフィンガープリントの結果を示す図である。
逆相ＨＰＬＣカラムＣ１８でトリプシンによって切断したＧ−ＣＳＦを分離した結果を示す図である。
逆相ＨＰＬＣカラムＣ１８でトリプシンによって切断したＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦを分離した結果を示す図である。
Ｎ末端のアミノ酸配列決定結果を示す図である。
ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの生物学的比活性を測定した結果を示す図である。
ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧ−ＣＳＦが６０Ｃｏサル好中球の対数変化に対する影響のトレンド図である。
ＰＥＧ−ＧＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの薬物代謝動態学曲線の比較を示す図である。]
[0031] 本発明は下記の非制限性の実施例を通じてさらに説明する。実施例からみると、既存の技術に比べて、本発明の利点は以下のとおりである。]
[0032] １．本発明のＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦは反応によってＹＰＥＧをＧ−ＣＳＦに修飾させ、得た反応混合物から有効的な精製手段によってＫ１７位のシングルポイント定位修飾生成物を獲得する。既知の技術におけるＮＨＳ−ＰＥＧの活性が高いため、選択性が悪く、修飾部位を指向的に選択することができなく、高純度のシングルポイント修飾生成物を得がたいなどの問題を解決し、大規模製造のとき品質コントロールを行い、ロット間の安定性も保証しやすくなる。]
[0033] ２．本発明のＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦは動物体内における循環半減期が修飾しないＧ−ＣＳＦに比べて顕著に延長する。]
[0034] ３．本発明のＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦは薬カ学の方面において非ＰＥＧ化のＧ−ＣＳＦに比べて明らかに改善する。具体的に、既知の技術におけるＧ−ＣＳＦに比べて、同じ総量あるいはより低い総量のＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦを投与すると、同じさらにより明らかな治療効果を実現する。]
[0035] 任意の例あるいはこれらの組合せに、本発明の範囲あるいは態様を限定するものではないと当業者は理解すべきである。本発明の範囲は添付の請求の範囲に限定され、本明細書および当該技術分野の一般的な常識を組み合わせて、当業者は、請求の範囲により限定される範囲を明確に理解することができる。]
[0036] 実施例１ ＹＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦ（ＹＰＥＧ−ＣＳＦ）の製造
４００ｍｇの９．５８ｍｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ原液のバッファー系を５０ｍＭホウ酸ナトリウムバッファー溶液（ｐＨ８．０）に替え、２ｍＭ ＨＣｌで４０ＫＤのＮＨＳ−ＹＰＥＧ（北京鍵凱科技有限公司（Jenkem Technology Co., Ltd.））３．２ｇを溶解し、タンパク：ＰＥＧ＝１：６（質量比）の比例で両者を混合した。４℃において３時間反応させ、生成物を１０ｍＭ ＮａＡｃ ｐＨ４．０で１５倍希釈し、１０ｍＭ ＮａＡｃ／ＨＡｃ ｐＨ４．０で平衡化した陽イオン交換カラム（ＧＥ社）に加え、１０ｍＭ ＮａＡｃ／ＨＡｃ ＋ＮａＣｌ １６０ｍＭ ｐＨ４．０バッファー溶液で勾配溶出し、四つ目の活性ピークを収集した（図２）。１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー溶液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−４００ＨＲカラム（ＧＥ社）を使って大分子ポリマーを除去し、活性ピークを収集した（図３）。限外ろ過し１０ｍＭ ＮａＡｃ ｐＨ４．０バッファー系に替え、スキャンによって合計してサンプル７３ｍｇを収めた。] 図２ 図３
[0037] 実施例２ ＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦの分子量分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで実施例１に製造したＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの分子量を測定した。ドイツＢＲＵＫＥＲ社のａｕｔｏｆｌｅｘ ＴＯＦ／ＴＯＦマススペクトロメトリーを採用し、ＴＯＦ／ＴＯＦＭＳ法でＹＰＥＧ−ｒＨｕＧ−ＣＳＦおよびｒＨｕＧ−ＣＳＦの分子量を測った。シナピン酸（Ｓｉｎａｐｉｎｉｃ ａｃｉｄ，ＳＡ，Ｃ１１Ｈ１２Ｏ５，ＭＷ ２２４．２２）を基質として用い、分析ソフトはｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓ Ｖｅｒ．３．０．５４．０．であった。]
[0038] 測定結果：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧ−ＣＳＦＭＳの分子量は約５９ｋＤで、理論分子量の５８８０１．８ダルトンと大体一致した。測定スペクトルを図４に示す。] 図４
[0039] ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧ−ＣＳＦはｒＨｕＧ−ＣＳＦのＹＰＥＧ修飾生成物である。修飾剤（ＹＰＥＧ）は一連の分子量が正規分布を呈するＹＰＥＧからなっている混合物で、平均分子量は４０ｋＤ±１０％である。ＹＰＥＧの分子量が正規分布を呈する特徴に基づいて、ＹＰＥＧ修飾生成物の分子量も正規分布を呈し（±１０％）、すなわちＹＰＥＧ−ｒＨｕＧ−ＣＳＦの分子量は５８８０２．０ダルトン±１０％であるはずである。]
[0040] 実施例３ ＰＥＧ化の修飾部位の確認
実施例１で製造したＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦのＰＥＧ化修飾部位を分析した。
Ｇ−ＣＳＦおよびＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦのバッファー溶液を５０ｍＭ （ＮＨ４）ＨＣＯ３、ｐＨ８．０に替え、１：２０の比例でエンドプロテアーゼ（Ｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）Ｇｌｕ−Ｃを加え、Ｇ−ＣＳＦおよびＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦを酵素切断し、得られたペプチド断片に対してＭａｌｄｉ−Ｔｏｆ法で分子量ペプチド断片フィンガープリントを描き、結果はそれぞれ図５および図６に示す。] 図５ 図６
[0041] 上記の結果から、Ｇ−ＣＳＦ／Ｇｌｕ−ｃを切断することによって、ＹＰＥＧの反応部位Ｍ１およびＫ１７（ＭＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬＬＫＣＬＥ、分子量２１３２．６Ｄ）を含む１〜２０番目のアミノ酸からなるペプチド断片、ＹＰＥＧの反応部位Ｋ２４（ＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥ、分子量１５１２．７Ｄ）を含む２１〜３４番目のアミノ酸からなるペプチド断片、および、ＹＰＥＧの反応部位Ｋ３５およびＫ４１（ＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥ、分子量１５３４．７Ｄ）を含む３５〜４７番目のアミノ酸からなるペプチド断片が得られることが分かった。しかし、ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ／Ｇｌｕ−ｃを切断する場合、１〜２０番目のアミノ酸からなるペプチド断片が得られず、２１〜３４番目のアミノ酸からなるペプチド断片（ＱＶＲＫＩＱＧＤＧＡＡＬＱＥ）および３５〜４７番目のアミノ酸からなるペプチド（ＫＬＣＡＴＹＫＬＣＨＰＥＥ）が得られることから、修飾反応はＫ２４、Ｋ３５およびＫ４１部位で行われておらず、Ｎ末端アミノ酸あるいは１７番目のリジンで行うことが判明された。それによって、該ペプチド断片の分子量は非修飾のペプチドに比べて４０ｋＤのＹＰＥＧが多くなり、分子量の変化を引き起こした。]
[0042] 上記の結論を実証するために、得たＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの酵素切断ペプチドマッピングおよび非修飾したＧ−ＣＳＦの酵素切断ペプチドマッピングを比べた。シークエンスグレードのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、豚、ｓｅｑ．ｇｒａｄｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ、＞５０００Ｕ／ｍｇ）をバッファー溶液に溶け、濃度を１μｇ／μｌにした。Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧを限外ろ過し、バッファー溶液を５０ｍＭ ＮＨ４ＨＣＯ３ ｐＨ８．０に替え、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの濃度を１ｍｇ／ｍｌにし、ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦサンプル溶液を得た。トリプシンを１μｌ取り、５０μｌのＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦサンプルを加え、３７℃において２４時間酵素切断をした。非修飾のＧ−ＣＳＦサンプルに対して同じように処理し、コントロールとして使われた。]
[0043] 逆相ＨＰＬＣカラムＣ１８で酵素切断のＧ−ＣＳＦおよびＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦサンプルを別々に分離した。カラムの固定相がオクタデシルシリルシリカゲルであり、規格がΦ４．６ｍｍ×１５０ｍｍで、粒径が５μｍで、孔径が３００Aである。移動相Ａは０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（Ｖ／Ｖ）で、移動相Ｂは０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮ（Ｖ／Ｖ）であった。流速が１．０ｍｌ／分である条件で濃度勾配溶出を行い、溶出勾配を表２に示す。得られた分離クロマトグラフを図７および図８に示す。] 図７ 図８
[0044] ]
[0045] ペプチドマッピングによると、ＰＥＧ修飾したＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦのペプチドマッピングにおける５２．４７９ｍｉｎ（分）に非修飾したＧ−ＣＳＦよりピークは一つ多かったが、３９．１７２ｍｉｎのピークがなくなった。この二つのペプチド断片を別々に収集し、収集したペプチド断片のＮ末端の５つアミノ酸配列をＥｄｍａｎ分解法で測定した結果、すべて同じＮ末端ＭＴＰＬＧを有した。このペプチド断片はＹＰＥＧと連結することによって、保留時間が変化したことから、ＹＰＥＧ化の修飾部位は確かにタンパクのＮ末端ペプチド断片にあることが判明された。]
[0046] 製造されたＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦのＮ末端配列を測定し、Ｎ末端１５個のアミノ酸配列ＭＴＰＬＧＰＡＳＳＬＰＱＳＦＬが測定された。ピーク形状について分析すると、１つ目のアミノ酸はＭｅｔであり、２つ目のアミノ酸Ｔｈｒに比べてピーク面積が顕著に小さいことは認められなかった（図９）。Ｎ末端に遊離状態のアミノ基が存在し、まだ修飾されていないと判明された。すなわち、ＰＥＧ修飾はＮ末端Ｍ１ではなく、Ｋ１７の上で行われた。実施例１に製造されたＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦはＫ１７のシングルポイント修飾であることが明らかになった。] 図９
[0047] 実施例４ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの生物学的活性の測定
１試薬の調整と細胞培養
１．１ １６４０培養液：ＲＰＭＩ１６４０液体培地、４℃に保存した。あるいは培地説明書の調整方法によって調整した。使う前に毎リットルの培地にペニシリンおよびストレプトマイシンを１０５ＩＵ／Ｌまで追加した。
１．２基本培養液：１６４０液に２．５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ，ｖ／ｖ）および１２．５％の馬血清（ＥＳ，ｖ／ｖ）を添加し、４℃に保存した。
１．３ 完全培養液：基本培養液に最終濃度が２０ｎｇ（２０００Ｕ）／ｍｌに達するまでにｒｈＧ−ＣＳＦを添加し、４℃に保存した。
１．４ ＮＦＳ−６０細胞株：完全培養液で３７℃，５％ＣＯ２の条件で培養し、４８〜７２時間において継代し、細胞濃度を２．０×１０５〜１０．０×１０５／ｍｌの間にコントロールし、前回継代の後２４〜３６時間にｒｈＧ−ＣＳＦ効力測定に用いられた。
１．５リン酸塩バッファー溶液（Ｈｙｃｌｏｎｅ）：塩化ナトリウム８ｇ、塩化カリウム０．２ｇ、リン酸水素ジナトリウム１．４４ｇ、リン酸ジ水素カリウム０．２４ｇを取り、超純水で１０００ｍｌの溶液を調節し、１２１℃において１５分間高圧滅菌をした。
１．６チアゾリルブルーＭＴＴ溶液：ＭＴＴ粉剤（Ｓｉｇｍａ）をリン酸塩バッファー溶液に溶け、５．０ｍｇ／ｍｌの溶液を調節し、０．２２μｍメンブランフィルターでろ過除菌を行い、４℃で日陰のところに保存した。
１．７溶解液
溶解液１：１％の濃塩酸、５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むイソプロピル溶液であり、室温で日陰のところに保存した。
溶解液２：２．８％の濃塩酸、１０％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むイソプロピル溶液であり、室温で日陰のところに保存した。]
[0048] ２．ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ生物活性の測定
２．１細胞懸濁液の調製
充分のＮＦＳ−６０細胞培養物を取り、遠心しＮＦＳ−６０細胞を収集し、リン酸塩バッファー溶液で３回洗い、再び基本培養液の中に懸濁した。細胞濃度は約２．０×１０５／ｍｌに調節し、３７℃で放置した。
２．２ Ｇ−ＣＳＦ標準物質（標準物質または中検所より提供されたｒｈＧ−ＣＳＦ国家標準物質；国際標準物質が参照として照合に使われ得る）および検査用サンプルは、タンパクの含有量を基準に基本培養液で２ｎｇ／ｍｌになるように希釈し、いずれのステップの希釈も１０倍を超えるべきでない。
２．３ ９６ウェル細胞培養プレートに前もって基本培養液を５０μｌ／ウェル加えた。２．２項の溶液を続けて２倍の勾配で希釈し、対照品および検査用サンプルについて８つの希釈度（１ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、０．２５ｎｇ／ｍｌ……）を有する希釈液を作り、５０μｌ／ウェルであった。別に陰性対照（ｒｈＧ−ＣＳＦを含まない）ならびに陽性対照（２ｎｇ／ｍｌのｒｈＧ−ＣＳＦを含む）を調製し、それぞれ少なくとも３ウェルずつであった。
２．４ 細胞懸濁液を５０μｌ／ウェルで加え、３７℃において、５％ＣＯ２で４０〜４８時間培養した。陰性細胞がほぼ破砕した（９５％）後、ＭＴＴ溶液を２０μｌ／ウェルで加え、３７℃において、５％ＣＯ２で４〜６時間培養した。
２．５溶解液１を１８０μｌ／ウェルあるいは溶解液２を１００μｌ／ウェル加え、均一に混合してから酵素標識メーターで比色し、検出波長を５７０ｎｍ、参照波長を６３０ｎｍに設定した]
[0049] ３．結果
ＯＤ５７０ｎｍ〜６３０ｎｍをＹ軸にし、プレートの希釈勾配の対数をＸ軸にし、標準物質および検査用サンプルの用量効果関係図を描いた。実験データは４つのパラメータ曲線回帰計算法で処理した。標準物質の最高勾配ＯＤ５７０ｎｍ〜６３０ｎｍ値ならび最低勾配ＯＤ５７０ｎｍ〜６３０ｎｍ値の平均値を半有効ＯＤ５７０ｎｍ〜６３０ｎｍ値にした。各サンプルの曲線に半有効ＯＤ５７０ｎｍ〜６３０ｎｍ値に当たる希釈勾配対数はこのサンプルのＣ値である。以下の式によって結果を計算した。
検査用サンプルの力価（ＩＵ／本）＝標準物質の力価×Ｃ１／Ｃ２×Ｄ１／Ｄ２×Ｖ
ここで、Ｃ１が標準物質の半有効量に相当する検査用サンプルの希釈倍数を、Ｃ２が標準物質の半有効希釈倍数を、Ｄ１が検査用サンプルの予備希釈倍数を、Ｄ２が標準物質の予備希釈倍数を、Ｖが包装量（ｍｌ）を、それぞれ表す。
検査の結果、実施例で製造したＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの生物学的比活性が２．９６×１０７ＩＵ／ｍｇ（図１０）。] 図１０
[0050] 実施例５ Ｙ型ポリエチレングリコール化顆粒球コロニー刺激因子（ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ）の薬効学的測定
一． ポリエチレングリコール化顆粒球コロニー刺激因子（ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ）が５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）によるマウス顆粒球減少症に対する治療効果
１． 材料及び方法
サンプル：ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ、規格：１ｍｌ／本、アンプルに包装された液体注射剤であり、２〜８℃において保存した。アモイ伯賽遺伝子転写技術有限公司より提供された。
陽性対照：グラン（Ｇ−ＣＳＦ）、３００μｇ／本、麒麟鯤鵬（中国）生物薬業有限公司（Kirin Kunpeng(China)Bio-Pharmaceutical Co., Ltd.）製品。保存：遮光、２〜８℃。]
[0051] 実験動物：マウス、昆明種、ＳＰＦ級、１４０匹、雄、舒泰神（北京）薬業有限公司（Staidson (Beijing) Pharmaceutical Co., Ltd）製品、実験動物生産承認番号ＳＣＸＫ−（京）−２００６−０００４。無作為に７群に振り分けた。それぞれ正常対照群、モデル対照群、低用量群１、低用量群２、中用量群、高用量群および陽性対照群であった。]
[0052] モデルの作り方：正常対照群のほかに、モデル対照群および各投与群はすべて１５０ｍｇ／ｋｇの５−ＦＵを投与し、翌日にサンプルあるいは対照品の治療を受けた。]
[0053] 投与量と頻度：ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧ−ＣＳＦの投与量が１５、５０、１５０、５００μｇ／ｋｇ、４日間おきに１回投与し、全部で３回投与した。陽性対照品の投与量が５０μｇ／ｋｇ、１〜１１日目に投与した。投与量は以下の表３に示す。]
[0054] 投与方法：正常対照群、モデル対照群を除き、ほかの各群はモデルを作ってから２４時間以降にサンプルおよび陽性対照品を投与し、投与頻度は表に示した通りである。皮下注射による投与であった。]
[0055] ２．結果
５−ＦＵの作用によって、マウスの好中球の数が減少し、３日間後ならびに９日間以内に多数の動物の全血好中球は極めて低く、機器で検出できなかった。そのため、本実験は、実験前、３日後ならびに９日後の好中球百分率をそれぞれ測り、好中球の絶対値（ＡＮＣ）を計算した。結果を表４に示す。結果によると、５−ＦＵの作用後、モデル対照群ならび１５μｇ／ｋｇ群の動物は投与の３日にＡＮＣが顕著に降下し、同時の正常対照群に比べて、顕著な差異が認められた（ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）が、５０−５００μｇ／ｋｇ群および陽性対照群のＡＮＣは降下せず、正常動物のＷＢＣ値ならび正常対照群に比べて、差異が認められなかった。サンプルは５０〜５００μｇ／ｋｇの投与量でＡＮＣの降下を緩和させられることがわかった。９日目の検査のとき、モデル対照群対照群はまた正常対照群より低く、１５０および５００μｇ／ｋｇ群は正常対照群を超え、陽性対照群は正常対照群のレベルに達した。１１日目におけるモデル対照群は正常対照群のレベルに達した。サンプルあるいは陽性対照品はいずれも動物の好中球をできるだけ早く正常レベルに回復できることが示唆された。]
[0056] ]
[0057] ]
[0058] ３．結論
本発明者らは、ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦは、明らかな持続効果のほかに、５−フルオロウラシルによるマウス好中球減少症に現れる外周血の好中球減少に対して、明らかに増強された保護促進効果を有することを発現した。ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦはマウス好中球減少症モデルの好中球低下の持続時間を明らかに短縮させ、外周血の好中球の数を迅速に回復させた。さらに、グランの１日に１回の投与で、１１回投与したこと（グラン５０μｇ／ｋｇ×１１）に比べて、ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦは４日間１回の投与で、３回投与したこと（低用量ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ ５０μｇ／ｋｇ×３、中用量ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ １５０μｇ／ｋｇ×３）を考慮すれば、本発明のＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ総投与量が明らかに減少したにもかかわらず、好中球の増加促進効果はグランと同程度またはより優れることが明らかである。]
[0059] 二．Ｙ型ＰＥＧ化組み換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧ−ＣＳＦ）が６０Ｃｏ ３．０Ｇｙ照射によるサル顆粒球減少症に対する治療効果
１．材料および方法
サンプル：ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ、規格：１ｍｇ／本、アンプルに包装された液体注射剤であり、２〜８℃において保存した。アモイ伯賽遺伝子転写技術有限公司（Biosteed Gene Expression Tech. Co. Ltd.）より提供された。
陽性対照品：グラン（Ｇ−ＣＳＦ）、３００μｇ／本、麒麟鯤鵬（中国）生物薬業有限公司製品。保存：遮光、２〜８℃。]
[0060] 実験動物：カニクイザル、一般グレード、雄雌、３〜４歳、体重２．５〜４．５ｋｇ、蘇州西山中科実験動物有限公司、実験動物生産承認番号：ＳＣＸＫ（蘇）２００２−００３２。モデル対照群は５匹の動物で、ほかの群はいずれも４匹の動物。]
[0061] モデルの作り方と投与方法：約３０日の検疫と予備飼育後、動物が群分けられ、６０Ｃｏで一回に３．０Ｇｙ全身照射され、照射量率が１．８Ｇｙ／分である。動物照射の当日から（５時間以内）薬物を投与し、後肢の内側で皮下注射した。表５に示す。]
[0062] ２．実験結果および分析
実験中、毎日動物の血液生化学検査を行い、好中球を計算した。その結果、ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧ−ＣＳＦ低、中、高用量群および陽性対照群のＡＮＣ平均値は同期のモデル対照群より高く、多くの時刻における投与群はモデル対照群に比べて統計学の差異がすべて認められた（ｐ＜０．０５あるいはｐ＜０．０１）。実験の結果を表６及び図１１に示す。] 図１１
[0063] ]
[0064] ]
[0065] ]
[0066] ]
[0067] ３．結論
Ｙ型ＰＥＧ化組み換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧ−ＣＳＦ）が６０Ｃｏ ３．０Ｇｙ照射によるサル顆粒球減少症に対して治療効果を有する。]
[0068] ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧ−ＣＳＦが持続効果を持ち、体内実験結果からみると、６日において本発明に製造したＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ２５μｇ／ｋｇを５回注射するのは毎日グランを１０μｇ／ｋｇ２５回注射するのに比べて、前者は総合投与量が減少する同時に、好中球の増加に対する刺激効果は後者と相当する。]
[0069] 実施例６．ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの動物体内薬物代謝動態学実験
１．実験方法と順序
１．１薬品および試薬
サンプル：ＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ、規格：１ｍｇ／本、アンプルに包装された液体注射剤であり、２〜８℃において保存した。アモイ伯賽遺伝子転写技術有限公司より提供された。
陽性対照品：グラン（Ｇ−ＣＳＦ）、３００μｇ／本、麒麟鯤鵬（中国）生物薬業有限公司製品。保存：遮光、２〜８℃。
１．２実験動物
カニクイザル６匹、雌３匹雄３匹。広西営林開発中心サル飼育基地製（合格証番号：ＳＣＸＫ（桂）２００５−０００５）、体重３．１１〜５．６２ｋｇ、ケージ別に飼育され、標準サル餌を与え、水を自由に与え、毎日新鮮な果物二回与えた。
１．３実験計画
実験は２群に分けて行われた。それぞれはＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦを３００μｇ／ｋｇ皮下注射する群と普通Ｇ−ＣＳＦ（グラン３００μｇ／ｋｇ）群であった。]
[0070] ２．実験方法
２．１血液サンプルの採集
ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧ−ＣＳＦを単回皮下注射した投与前、投与後０．２５、０．５、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈ、２４ｈ、４８ｈ、９６ｈ、１６８ｈ、２４０ｈ、３１２ｈ、３８４ｈおよび４８０ｈに投与した後肢の対側の後肢から静脈血を１ｍＬ採血した。グラン（Ｇ−ＣＳＦ）群は投与前、投与後５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間に静脈血を１ｍＬ採血した。血液サンプルを４℃において３０分放置した後、３０００回転で１０分低温遠心分離してからすぐ分離した血清を−２０℃において保存し分析に供する。]
[0071] ２．２血清薬物濃度測定
免疫定量キット（ＥＬＩＳＡ法）でカニクイザル血清中のＧ−ＣＳＦあるいはＹＰＥＧ−ｒＨｕＧ−ＣＳＦの薬物濃度を測った。Ｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＨｕｍａｎ Ｇ−ＣＳＦＥＬＩＳＡキットで血清中のＧ−ＣＳＦならびＹＰＥＧ−ｒＨｕＧ−ＣＳＦの濃度を測るＥＬＩＳＡ方法を立てた。]
[0072] ２．２．１測定原理の概要
このキットの分析に定量サンドイッチ技術を利用する。予め組み換えヒトＧ−ＣＳＦ特異的なモノクローナル抗体をミクロウェルプレートにコーテイングした。標準品およびサンプルをウェルに吸い入れ、その中のＧ−ＣＳＦあるいはＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦは固定化抗体と結合した。結合しない物質を洗い、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を結びついたアンチヒトＧ−ＣＳＦのＩｇＧをウェルに加え、結合しない抗体—酵素試薬を洗い、ウェルにＨＲＰの基質溶液を加え呈した色は最初の結合したＧ−ＣＳＦあるいはＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの量と比例関係を持っている。反応を終止させ、色の強度を測定する。吸光度Ｏ．Ｄ．値が高ければ高いほど、サンプルの中のＧ−ＣＳＦあるいはＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの濃度が高い。]
[0073] ２．２．２測定のステップ
測定操作は完全にキットの説明書に準じて行われた。ウェルに１００μＬの標準品あるいは血清サンプルを加え、プレートミキサーで軽く均一に混合し、未知サンプルの予期濃度によって、希釈液で標準校正曲線の濃度範囲に希釈した。各プレートに組み換えＧ−ＣＳＦあるいはＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの標準校正曲線を設定し、このプレートにある未知サンプルの濃度を計算した。室温で１ｈインキュベーションした。プレートを洗液で３回洗った。ウェルに１００μＬの二次抗体を加え、続けて室温で１ｈ反応させ、ウェルに１００ＴＭＢ基質を加え、室温で１５分遮光放置した。ウェルに１００終止液を加え、軽く均一に混合し、反応を終止させた。５分以内にマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍ波長の吸光度ＯＤを測った。]
[0074] ２．２．３結果の計算
Ｏｒｉｇｉｎソフトで濃度の対数ならび光吸収ＯＤ値の対数を標準曲線に描いた。未知サンプルの９６ウェルプレートに設計された標準曲線を利用して、直線性回帰でサンプルの中の組み換えＧ−ＣＳＦあるいはＹＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの濃度を計算し、希釈倍数で校正してから薬物血中濃度を求めた。]
[0075] ２．３実験の統計方法ならび薬物動態学のパラメータの計算
非コンパートメントモデルの統計学的モーメント法で各薬物動態学のパラメータを計算する。計算用のソフトが３Ｐ９７であった。サル自身データの比較にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓペアｔ−検定法で統計し、異なるサルに対して、群別ｔ−検定法で統計し、すべてＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｅｘｅｃｌ（バージョンＸＰ）に提供された統計ソフトで計算した。実験結果の直線性回帰にはＯｒｉｇｉｎソフトで回帰方程式および関連統計パラメータを求め、薬物動態学曲線の比較を図１２に示す。] 図１２
[0076] カニクイザルにＹＰＥＧ−ｒＨｕＧ−ＣＳＦを３００ｇ?ｋｇ−１単回皮下注射した後、血清中のＹＰＥＧ−ｒＨｕＧ−ＣＳＦ濃度は皮下注射後８〜２４ｈにピークになり、Ｃｍａｘは４．５３±０．８６ｇ?ｍＬ−１であった。末端半減期がそれぞれ７７．５５±０．３４ｈで、ＭＲＴが９５．０３±１４．５１ｈであった。ＡＵＣ（０〜４８０ｈ）が５３４．７５±１５５．２８μｇ・ｈ・ｍＬ−１で、ＡＵＣ（０〜∞）が５３９．２７±１５８．３２μｇ・ｈ・ｍＬ−１であった。平均除去率が０．６０±０．２０ｍＬ・ｋｇ−１・ｈ−１で、基本的に線性薬物動態学の特徴を呈した。]
実施例

[0077] Ｇ−ＣＳＦを３００μｇ．ｋｇ−１単回皮下注射した後、Ｃｍａｘが２．４９±０．２０μｇ・ｍＬ−１、ＡＵＣ（０〜２４ｈ）が２３．０７±２．９３μｇ・ｈ・ｍＬ−１、末端半減期が４．００±１．４４ｈ、ＭＲＴが６．４８±１．３５ｈ、ＶＳＳが７２．５３±１８．８６ｍＬ・ｋｇ−１であった。ＹＰＥＧ−ｒＨｕＧ−ＣＳＦのカニクイザルにおける薬物動態学の特徴に比べて差別は非常に明らかであった。Ｇ−ＣＳＦをＹ型ＰＥＧ化した後、消失速率係数、除去率ならび見かけの分布容積はすべて明かに減少し、ＭＲＴおよび末端半減期は顕著に延長した（７７．５５±０．３４ｈ ｖｓ ４．００±１．４４ｈ）。]

权利要求:

請求項1
一般式（Ｉ）の構造を有するＹ型ポリエチレングリコール化Ｇ−ＣＳＦ。 （ここで、ＲおよびＲ’は、独立して低分子量のアルキル基、好ましくはメチル基であり、ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数であり、ｍ＋ｍ’は好ましくは６００から１５００までであり、Ｒｉは水素、置換あるいは無置換のＣ１〜１２アルキル基、置換アラルキル基、アリール基またはヘテロアルキル基であり、ｊは１〜１２の整数であり、Ｆはヒドロキシル基、カルボキシル基、エステル基、アシルクロライド、ヒドラジド、マレイミド、ピリジンジスルフィドからなる群から選ばれる末端基であり、Ｇ−ＣＳＦにあるアミノ基、ヒドロキシル基またはメルカプト基と反応して共有結合を形成する。）
請求項2
Ｙ型ポリエチレングリコールが末端のカルボキシル基によってＧ−ＣＳＦのアミノ基と結合する、一般式（ＩＩ）の構造を有する、請求項１に記載のＹ型ポリエチレングリコール化Ｇ−ＣＳＦ。 （ここで、ＲおよびＲ’はすべてメチル基であり、ｊは１〜１２の整数であり、ｍ＝ｍ’かつｍ＋ｍ’は６００から１５００までである。）
請求項3
前記アミノ基がＧ−ＣＳＦにおいて配列番号１の１７番目のリジンに対応する側鎖εアミノ基である、請求項２に記載のＹ型ポリエチレングリコール化Ｇ−ＣＳＦ。
請求項4
前記ポリエチレングリコールの総平均分子量が約１００００〜６００００ダルトンであり、好ましくは４００００±４０００（１０％）ダルトンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＹ型ポリエチレングリコール化Ｇ−ＣＳＦ。
請求項5
前記Ｇ−ＣＳＦは天然物から抽出、または組み換えバイオテクノロジーによって得られたＧ−ＣＳＦであり、好ましくは、配列番号１に示す配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＹ型ポリエチレングリコール化Ｇ−ＣＳＦ。
請求項6
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＹ型ポリエチレングリコール化Ｇ−ＣＳＦまたは請求項６に記載の組成物の、Ｇ−ＣＳＦ治療を必要とする疾患の治療薬の製造における使用であって、前記Ｇ−ＣＳＦ治療を必要とする疾患は、例えば重度の感染、白血病、幹細胞移植および悪性固形腫瘍の化学放射線療法等による顆粒球減少症である、使用。
請求項7
請求項３に記載のＹ型ポリエチレングリコール化Ｇ−ＣＳＦを製造および精製する方法であって、（ａ）一般式（ＩＩＩ）の構造を有するＹ型分岐構造のＰＥＧとＧ−ＣＳＦとの両者をタンパク：ＰＥＧ＝１：６（質量比）の比例で混合し、４℃において反応させＹＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦを得るステップと、（ここで、ＲおよびＲ’はメチル基で、ｊは１〜１２の整数で、ｍおよびｍ’は重合度を表し、任意の整数であり、ｍ＋ｍ’好ましくは６００から１５００までである。）（ｂ）生成物を１０ｍＭＮａＡｃｐＨ４．０で希釈し、１０ｍＭＮａＡｃ／ＨＡｃｐＨ４．０で平衡化した陽イオン交換カラムに加え、１０ｍＭＮａＡｃ／ＨＡｃ＋ＮａＣｌ１６０ｍＭｐＨ４．０バッファー溶液で勾配溶出し、四つ目の活性ピークを収集し、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー溶液（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−４００ＨＲカラム（ＧＥ社）を使って大分子ポリマーを除去し、活性ピークを収集しＫ１７位に修飾したＹ型ポリエチレングリコール化Ｇ−ＣＳＦを得るステップとを含む、方法。
請求項8
請求項３に記載のＹ型ポリエチレングリコール化Ｇ−ＣＳＦを投与することを含む、顆粒球減少症を治療する方法。